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腸道腫瘤類器官的研究與應(yīng)用

更新時間:2022-02-23點擊次數(shù):2709

ONCOGENESIS|腸道腫瘤類器官的應(yīng)用研究


 

類器官(Organoids)

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什么是類器官(Organoids)?

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類器官的應(yīng)用前景

創(chuàng)新性,近年來一直是研究熱點,到目前為止已取得多項重大研究領(lǐng)域的突破‍,但其應(yīng)用研究目前依然處于起步階段,其作為一種工具,在廣泛的應(yīng)用研究方面潛力巨大,包括發(fā)育生‍物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生機(jī)制、精準(zhǔn)醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗。對于這些應(yīng)用以及其他應(yīng)用,類器官培養(yǎng)‍實現(xiàn)了對現(xiàn)有2D培養(yǎng)方法和動物模型系統(tǒng)的高信息量的互補。此外,通過類器官繁殖的干細(xì)胞群取代受損或者患病的組織,類器官提供自體和同種異體細(xì)胞療法的可行性,未來這一技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有巨大的潛力。

研究思路分享

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圖:研究概要和亮點

1. 與mNPO相比,mPO中葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量增加

腺癌是常見的小腸癌類型,大多數(shù)這些腫瘤發(fā)生在十二指腸,這是小腸最靠近胃的部分。為了分析小息肉和非息肉部位中的葡萄糖和乳酸代謝譜,研究者構(gòu)建小鼠十二指腸息肉衍生類器官(mPO)與非息肉衍生類器官(mNPO)模型,通過對其培養(yǎng)基分析發(fā)現(xiàn),與mNPO相比,mPO的葡萄糖消耗率和乳酸生成更高,這表明代謝向無氧糖酵解的轉(zhuǎn)變以維持更高的mPO生長和新的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。

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為了驗證上述代謝測定中的結(jié)論,研究者采用qPCR分析了12個代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平,所選基因均參與細(xì)胞代謝過程(葡萄糖、活性氧、脂肪酸攝取和組織重塑)。結(jié)果表明Aldob、Cyba、HexII、Fabp6、Slc2a5和Spock 1(又名Testican-1,是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白)、Spock2的表達(dá)水平上調(diào),而G6pc、Slc2a1和Slc2a2下調(diào),但是Ephx2和Gstt1在mPO與mNPO中沒有變化。蛋白質(zhì)印跡分析也證實了SPOCK1和SPOCK2蛋白在mPO中被誘導(dǎo),這與 mRNA水平的表達(dá)相一致。其中,SPOCK1 是 TGF-β的正向下游調(diào)節(jié)因子,其表達(dá)通過 Wnt/β-catenin 途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。除了生理功能外,SPOCK1還是CRC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

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2. 分析mPO與mNPO中癌癥相關(guān)miRNA的表達(dá)差異

為了鑒定息肉腫瘤發(fā)展過程的miRNA,采用miRCURY LNA miRNA測定十二指腸 mNPO和mPO之間的miRNA表達(dá)譜,使用Exiqon-GenEx-qPCR分析軟件對miRNA表達(dá)(2^–ΔΔCT) 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計分析。最終,鑒定了幾個與癌癥相關(guān)miRNA,與mNPO相比,在mPO中的表達(dá)存在顯著差異。其中包括 let-7 家族成員在內(nèi)的幾種 miRNA顯著下調(diào),以及13個miRNA在mPO中顯著上調(diào)表達(dá)(>3倍)。

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3. miR-135靶向代謝介質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白SPOCK1

通過TargetScan Web預(yù)測發(fā)現(xiàn)Spock 1是miR-135的潛在靶標(biāo)。而且,SPOCK1的表達(dá)增加與人結(jié)腸腺癌(COAD)的總生存期(OS)差有關(guān)。階段圖分析表明,在COAD癌癥階段,SPOCK1的表達(dá)逐漸升高,在晚期階段(StageIII 和StageIV)的表達(dá)相對最高。

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對預(yù)測的miR-135-5p的系統(tǒng)搜索分析顯示,超過670個預(yù)測基因與細(xì)胞代謝(葡萄糖、活性氧、代謝、代謝、脂肪酸攝取和組織微環(huán)境)相關(guān)。先前的研究也表明,抑制CRC小鼠模型中的miR-135b,可通過控制增殖、侵襲和凋亡相關(guān)基因,進(jìn)而降低腫瘤生長,其可作為檢測CRC和晚期腺瘤的無創(chuàng)生物標(biāo)志物。臨床患者衍生的類器官 (PDOs)這代表了一個臨床相關(guān)的研究平臺。接下來,研究團(tuán)隊培養(yǎng)了患者來源的腫瘤類器官(tPDO)和鄰近的癌旁來源的類器官(hPDO) 。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)CRC tPDO 中SPOCK1和miR-135b的表達(dá)水平顯著高于CRC hPDO。

為了研究miR-135b對SPOCK1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用,用對照載體慢病毒(Control)或 miRZip-135b(anti-miR-135b)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)tPDO,而后驗證了抗miR-135b顯著降低了CRC tPDO中miR-135b的表達(dá)水平。為了確認(rèn)miR-135b/ SPOCK1軸能夠影響tPDO中的代謝反應(yīng),對重要的腫瘤代謝物濃度(抗miR-135b處理的類器官培養(yǎng)基中的乳酸和葡萄糖)進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)抗miR-135b可減少葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。此外,為了確認(rèn)miR-135b/ SPOCK1轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸,又開展了雙熒光素酶報告分析,發(fā)現(xiàn)與抗miR-135b共轉(zhuǎn)染顯著抑制了含有野生型SPOCK1 3'-UTR-reporter的細(xì)胞中熒光素酶活性,而非突變型SPOCK1 3'-UTR-reporter。此外,抑制CRC tPDO中的miR-135b表達(dá)后,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SPOCK1 mRNA水平顯著降低,而SPOCK2沒有變化??傊?,以上結(jié)果證明了SPOCK1是miR-135b的靶標(biāo)基因,用抗miR-135b治療能夠降低SPOCK1的表達(dá)。

Fig5.jpg


4. 抑制miRNA-135/ SPOCK1軸使tPDOs細(xì)胞對5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制作用和細(xì)胞毒性敏感

研究團(tuán)隊在tPDO中敲低miR-135b后進(jìn)行了5-FU(5-Fluorouracil)的細(xì)胞抑制和形態(tài)學(xué)測定,發(fā)現(xiàn)與miRZip-135b的聯(lián)合治療可使tPDOs細(xì)胞對5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制作用敏感,并加劇了對SPOCK1 基因表達(dá)的抑制作用。

Fig6.jpg

此外,通過 SRB 比色法評估了同步/血清饑餓的人APC突變的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系DLD-1 與正常結(jié)腸細(xì)胞CCD-841在用10次增加劑量的5-FU±anti-miR-135治療后的存活率。結(jié)果表明,與CCD-841-anti-miR-135細(xì)胞(IC50=17.48±1.083)相比,5-FU在DLD-1-anti-miR-135(IC50=10.86±1.135)中表現(xiàn)出更大的細(xì)胞毒性。miR-135b敲低(+anti-miR-135) 對結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞的敏感性高于非癌性(CCD-841) 細(xì)胞[DLD-1+anti-miR-135(IC50=5.383±1.188) vs. CCD-841+抗miR-135細(xì)胞(IC50= 14.07±1.103)]。選擇性指數(shù)(SI)的計算方法是將抗miR-135細(xì)胞的IC50除以 miR-135b敲低細(xì)胞的IC50(DLD-1 SI=2.017 vs. CCD-841 SI=1.242)。SI是一個給出選擇性概念的指標(biāo),最高值表示更具選擇性的候選者。我們的數(shù)據(jù)與miR-135抑制可影響CRC細(xì)胞系對化療藥物耐藥性的觀察結(jié)果一致。

本文小結(jié)

本研究創(chuàng)新性地采用腸道類器官模型,研究腫瘤和鄰近的非腫瘤類器官(tPOh和tNPO)中具有不同的代謝活性,以及與代謝相關(guān)的miRNA表達(dá)譜,并確立了miR-135通過靶向SPOCK1從而影響細(xì)胞代謝的關(guān)鍵作用,證明了miR-135和SPOCK1協(xié)同影響腫瘤細(xì)胞的代謝和藥物反應(yīng)。這為CRC的治療提供了新的思路和理論依據(jù),也為類器官模型在腫瘤藥物篩選的研究和應(yīng)用方面打下了一定程度的基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)來源:Babaei-Jadidi, R., Kashfi, H., Alelwani, W. et al. Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the influence of metabolism on drug response in intestinal/colon tumour organoids. Oncogenesis 11, 4 (2022). 

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END


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