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細(xì)胞增殖分析(CCK-8 法)

更新時(shí)間:2022-09-19點(diǎn)擊次數(shù):2707

Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。


CCK-8 & MTT 方法比較

方法

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

CCK-8

靈敏度高、不使用有機(jī)溶劑、檢測迅速、重復(fù)性好

價(jià)格較MTT貴、CCK8試劑的顏色為淡紅色、與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,容易漏加或多加

MTT

價(jià)格便宜

操作步驟較多,需要使用有機(jī)試劑,靈敏度不如CCK-8,多數(shù)需要配制,檢測時(shí)間長,細(xì)胞毒性較高


一、原理:

CCK-8 MTT 的升級(jí)產(chǎn)品,其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。

生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,與細(xì)胞毒性成反比,間接反映活細(xì)胞數(shù)量。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

二、用途:

用于細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、藥物篩選、抗腫瘤藥物敏感性測定。

三、材料與儀器

【材料】細(xì)胞懸液

【試劑】 CCK8

【儀器,耗材】96 孔板,二氧化碳培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀

四、步驟:

1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù);

2、根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)接種到 96 孔板中,每孔約 200 ul2×103-2×104/孔)細(xì)胞懸液,同樣的樣本可做 3-5 個(gè)重復(fù),將 96 孔板在 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,48,72 h;

3、設(shè)置空白對照組:不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照,其他試驗(yàn)步驟保持一致。細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4-8小時(shí);

4、加入20ul CCK8:由于每孔加入CCK8 量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?;蛘咧苯优渲煤?10% CCK8 的培養(yǎng)基,以換液的形式加入;

5、培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續(xù)培養(yǎng),以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時(shí)間(5-6小時(shí));

6、測定 450 nm吸光度:建議采用雙波長進(jìn)行測定,檢測波長 450-490 nm,參比波長600-650 nm。

五、注意事項(xiàng)

1、當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā),由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS,不作為測定孔用。避免邊緣效應(yīng)。    

2、用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡,否則會(huì)干擾測定,且要擦拭干凈樣品板。

3、細(xì)胞種板數(shù)不易過多,否則細(xì)胞自身發(fā)生接觸抑制,影響OD數(shù)值,較長培養(yǎng)時(shí)間建議每孔加入200μl培養(yǎng)基。                                  

4.若暫時(shí)不測定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測定,吸光度不會(huì)發(fā)生變化。        

5、懸浮細(xì)胞由于染色比較困難,一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。

6、加入CCK-8 時(shí),如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長,培養(yǎng)基顏色或 pH 值已變化,建議換用新鮮的培養(yǎng)基。



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