原代細(xì)胞分離培養(yǎng)中的注意事項(xiàng)

　　原代培養(yǎng)的細(xì)胞，來源于胚胎、組織器官和外周血，通過特殊的分離方法制備，稱為原代細(xì)胞。初步分離得到的細(xì)胞具有與體內(nèi)細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，是研究生進(jìn)行與物體相關(guān)的生命活動的理想材料。

　　

　　原代細(xì)胞分離培養(yǎng)是從體內(nèi)取出人/小鼠模型動物特異性細(xì)胞，用胰蛋白酶和螯合劑(EDTA)處理，分散成單細(xì)胞，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得細(xì)胞能夠存活、生長和繁殖的過程。原代培養(yǎng)是指細(xì)胞、組織和器官直接從體內(nèi)取出后立即進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)的細(xì)胞保持了原細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，則仍保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，一代至第十代內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞一般稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。常用的原代培養(yǎng)是組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
 

　　

　　原代細(xì)胞分離培養(yǎng)中的注意事項(xiàng)：

　　

　　1、原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選擇繁殖能力強(qiáng)的組織，如胚胎、幼體或腫瘤組織等。

　　

　　2、注意無菌操作。

　　

　　3、整個(gè)取樣操作要迅速，尤其是孕鼠要在乙醇中浸泡1min左右，時(shí)間不宜過長，以保證胚胎細(xì)胞的活性。

　　

　　4、采用消化法時(shí)，胰酶的溫度應(yīng)低于37℃，胰酶的濃度應(yīng)僅為平時(shí)消化細(xì)胞濃度的一半。因?yàn)檫@個(gè)過程不像細(xì)胞消化培養(yǎng)時(shí)的1~10min，而是至少20min，一次消化的細(xì)胞在這個(gè)胰蛋白酶消化液中繼續(xù)消化10min以上。所以胰酶不能作用太強(qiáng)，否則這些細(xì)胞容易受損，不容易存活。

　　

　　5、如果采用組織塊法，應(yīng)在組織塊略干，能貼在瓶壁上時(shí)，與培養(yǎng)液接觸，使組織塊能浮起。如果組織塊不貼在壁上，細(xì)胞就不容易生長，即使生長也不貼在瓶壁上，生長中的細(xì)胞因?yàn)闊o法觀察而無法收集。

　　

　　6、在原代培養(yǎng)操作中，也可用無血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

　　

　　7、新生乳鼠也可作為原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的培養(yǎng)材料。此時(shí)應(yīng)將乳鼠浸泡在75%的乙醇中2~3分鐘，使皮膚充分消毒。因?yàn)槿槭蟮脑囵B(yǎng)有較高的污染概率，所以要小心處理，避免細(xì)菌污染。乳鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞存活率不如胚胎細(xì)胞培養(yǎng)成功率高。