VEGF-aPMNEM-ECM抗菌促愈合水凝膠

更新時(shí)間：2024-11-19

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慢性糖尿病傷口主要由感染、炎癥和血管生成相關(guān)疾病引起。治療慢性糖尿病傷口的理想方法是結(jié)合抗感染策略、免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)和促進(jìn)血管生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)血管生成。然而，其穩(wěn)定性低，不能靶向病灶，限制了其應(yīng)用。多形核中性粒細(xì)胞衍生外泌體（PMNExo）具有良好的遞送特性，可用于VEGF的治療遞送，此外，它們還保留了多形核中性粒細(xì)胞（PMN）的抗菌能力。然而，低PMNExo生成阻礙了其治療應(yīng)用。本文作者Yanzhen Yu等采用了擠壓法制備了PMNs外泌體模擬物（EM），成功在Journal of Nanobiotechnology上發(fā)表篇名為An injectable, activated neutrophil-derived exosome mimetics/extracellular matrix hybrid hydrogel with antibacterial activity and wound healing promotion effect for diabetic wound therapy的研究成果，將VEGF封裝的活化中性粒細(xì)胞外泌體模擬物（aPMNEM）裝入ECM，以開(kāi)發(fā)用于治療慢性傷口的VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝膠。下面小編帶大家了解一下本文的主要研究成果。

VEGF-aPMNEM-ECM抗菌促愈合水凝膠

01：VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝膠的制備與表征

在本研究中，作者將VEGF封裝的活化中性粒細(xì)胞外泌體模擬物（aPMNEM）裝入ECM，以開(kāi)發(fā)用于治療慢性傷口的VEGF-aPMNEM-ECM。首先對(duì)納米材料進(jìn)行合成，而后驗(yàn)證aPMNEM的質(zhì)量，作者使用了TEM，Western blotting, NTA和Zeta電位測(cè)量進(jìn)行了表征。TEM和NTA結(jié)果顯示，aPMNEM的直徑約為160nm，與PMNExo、aPMNExo和PMNEM的大小相似。Zeta電位測(cè)量顯示，aPMNEM的電位約為-40 mV，與PMNExo、aPMNExo和PMNEM的表面膜電位相似。為了量化aPMNEM的產(chǎn)量，作者測(cè)量了由相同數(shù)量的細(xì)胞通過(guò)NTA產(chǎn)生的PMNExo、aPMNExo、PMNEM和aPMNEM的數(shù)量。NTA顯示，通過(guò)多層過(guò)濾擠出生產(chǎn)的aPMNEM產(chǎn)量約為aPMNExo產(chǎn)量的10倍。接下來(lái)，為了研究aPMNEM的質(zhì)量，作者進(jìn)行了4D無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并通過(guò)主成分分析（PCA）、火山圖分析和熱圖分析比較了aPMNEM和PMNExo的蛋白質(zhì)含量。PCA顯示aPMNEM和PMNExo蛋白含量不同。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與PMNExo相比，aPMNEM中有1807種不同的蛋白質(zhì)類型具有顯著差異。與PMNExo相比，aPMNEM中差異表達(dá)的蛋白中有1501個(gè)蛋白上調(diào)（折疊變化>2），306個(gè)蛋白下調(diào)（折疊變化>2）。GO注釋分析顯示aPMNEM與PMNExo具有相似的生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。在殺菌相關(guān)蛋白中，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白（LCN2）、溶菌酶（LYZ）和肽聚糖識(shí)別蛋白（PGLYRP1）上調(diào)，而補(bǔ)體C3（C3）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）和補(bǔ)體C4-B（C4B）在PMNEM中與PMNExo相比下調(diào)。最后作者通過(guò)物理冷凍結(jié)合SDS-Triton洗脫法制備了溫度敏感的ECM水凝膠。

VEGF-aPMNEM-ECM抗菌促愈合水凝膠

02：aPMNEM分子清創(chuàng)

作者通過(guò)4D無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，分析其蛋白質(zhì)含量來(lái)確定aPMNEM的組成。結(jié)果顯示，aPMNEM含有3386個(gè)蛋白，通過(guò)分子功能分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白參與了氧化還原酶的活性，這可能是aPMNEM具有抗菌活性的原因之一。而后為了驗(yàn)證aPMNEM的抑菌能力，作者首先在體外研究了aPMNEM對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落生長(zhǎng)抑制作用。研究結(jié)果表明，aPMNEM處理3小時(shí)可有效抑制體外培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。隨后，用aPMNEM治療大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染的大鼠傷口。組織的Giemsa結(jié)果顯示，aPMNEM成功地抑制了細(xì)菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)，這與aPMNEM體外抑菌試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。為了評(píng)估aPMNEM的抗炎作用，作者測(cè)定了對(duì)照組和aPMNEM組感染創(chuàng)面和血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-6水平在24和48 h時(shí)的變化。qPCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和aPMNEM組感染創(chuàng)面中炎癥因子水平在24 h時(shí)無(wú)顯著變化。

VEGF-aPMNEM-ECM抗菌促愈合水凝膠

03：VEGF-aPMNM - ECM對(duì)體內(nèi)重要器官的影響及生物分布

為了驗(yàn)證VEGF-aPMNM-ECM的生物相容性，作者通過(guò)H&E染色法觀察這些器官的生理結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，與PBS處理的對(duì)照組相比，VEGF-aPMNM-ECM對(duì)SD大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型無(wú)明顯的病理改變，說(shuō)明VEGF-aPMNM-ECM對(duì)SD大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型無(wú)毒性作用。同時(shí)使用了小動(dòng)物體內(nèi)成像驗(yàn)證VEGF - aPMNEM在創(chuàng)面的生物分布，顯示出aPMNEM在傷口部位保持48小時(shí)的功能，并且不隨時(shí)間擴(kuò)散。

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04：VEGF-aPMNEM-ECM在皮膚傷口愈合中的體內(nèi)體外應(yīng)用能力探究

作者建立大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型，并給予多種治療。結(jié)果顯示，與其他治療方法相比，VEGF-aPMNEM-ECM治療可能更能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。治療14天后取出創(chuàng)面組織，進(jìn)行H&E和Masson染色、免疫組化分析和免疫熒光（IF）分析。H&E染色結(jié)果證實(shí)，四組中VEGF-aPMNEM-ECM處理傷口邊緣最短，上皮化程度最高。Masson染色結(jié)果顯示，與其他三組相比，VEGF-aPMNEM-ECM組傷口部位膠原沉積最多，膠原排列更有序。通過(guò)CD31和α-SMA抗體的免疫組化和IF 分析，VEGF-aPMNEM-ECM治療組血管數(shù)量最多，其次是ECM和aPMNEM-ECM治療組，PBS治療組血管數(shù)量較少。這些結(jié)果表明VEGF-aPMNEM-ECM通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)促進(jìn)皮膚傷口愈合。為了證實(shí)VEGF-aPMNEM-ECM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的治療潛力，作者使用VEGF-aPMNEM-ECM進(jìn)行了血管形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，VEGF-aPMNEM-ECM促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞向血管的轉(zhuǎn)化，VEGF-aPMNEM-ECM組血管總長(zhǎng)度和支管長(zhǎng)度最長(zhǎng)。

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VEGF-aPMNEM-ECM在皮膚傷口愈合中的體內(nèi)體外應(yīng)用能力探究

05：VEGF-aPMNEM-ECM對(duì)炎癥微環(huán)境的體內(nèi)調(diào)節(jié)作用

VEG為了確定ECM的組成，作者通過(guò)進(jìn)行4D無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析來(lái)分析ECM的蛋白質(zhì)含量。在ECM水凝膠中共發(fā)現(xiàn)112種蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)研究揭示了ECM與“細(xì)胞外成分"之間的相關(guān)性。根據(jù)以往的研究，那些數(shù)量較多的蛋白，如膠原I，可使M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2巨噬細(xì)胞。CD86 (M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物)和CD206 (M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物)抗體IF分析結(jié)果證實(shí)，ECM、aPMNEM - ECM和VEGF-aPMNEM-ECM治療組顯著誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化；但三組間無(wú)明顯差異。

VEGF-aPMNEM-ECM抗菌促愈合水凝膠

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們不難看出，此研究成功開(kāi)發(fā)了一種新型的VEGF-aPMNEM-ECM生物材料，用于治療慢性糖尿病傷口。該材料利用PMN衍生的外泌體模擬物作為載體，保護(hù)VEGF免受降解，并通過(guò)ECM水凝膠延長(zhǎng)其在傷口部位的駐留時(shí)間，且在促進(jìn)傷口愈合方面顯示出良好的生物相容性和生物安全性。作者團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)的VEGF-aPMNEM-ECM納米材料為糖尿病創(chuàng)傷治療提供了一個(gè)有前景的平臺(tái)，通過(guò)在aPMNEM-ECM中加載各種可用的細(xì)胞因子，有潛力應(yīng)用于不同疾病的治療，為糖尿病傷口治療提供了新的策略。

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