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細胞培養(yǎng)基大盤點

更新時間:2022-01-25點擊次數(shù):3510

 

細胞培養(yǎng)基的概念
 

01

細胞培養(yǎng)基是人工模擬細胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境,并提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的基礎物質(zhì)。細胞培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的基礎,它為動物細胞的健康快速成長提供營養(yǎng)物質(zhì)。所以,只要用到細胞進行生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)制造,就勢必少不了細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)液或培養(yǎng)基,英文都是medium。當它是粉劑時,傾向性地稱為培養(yǎng)基,而將粉劑配成液體后,多稱為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中常需補加血清、抗生素等成分。                             

 

細胞培養(yǎng)基的分類
 
02

培養(yǎng)基主要有:天然細胞培養(yǎng)基、合成細胞培養(yǎng)基和無血清細胞培養(yǎng)基等。

天然細胞培養(yǎng)基是人們早期采用的細胞培養(yǎng)基,直接取自于動物組織提取液或體液,如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養(yǎng)價值高,但成分復雜,差異大、不穩(wěn)定,來源也受限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基,富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中有效的培養(yǎng)添加物,但其組成成分復雜,其中一些成分與功能不明確。血清的來源有胎牛血清、小?;虺膳Q濉ⅠR血清、雞血清、羊血清及人血清,廣泛應用的為胎牛血清和小牛血清。

合成細胞培養(yǎng)基是用化學成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基,組分穩(wěn)定,主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類等。1950年,Morgan成功研制出具有確定化學成分的細胞培養(yǎng)液,即M199培養(yǎng)基,可用于培養(yǎng)多種種屬來源的細胞。1951年,Harry Eagle研發(fā)了動物細胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基,即Eagle's minimum essential medium基(MEM培養(yǎng)基),是目前使用廣泛的合成細胞培養(yǎng)基之一。合成細胞培養(yǎng)基發(fā)展至今已有幾十種,除了沿用半個世紀的基礎合成細胞培養(yǎng)基之外,近年來還出現(xiàn)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞培養(yǎng)基。

在細胞培養(yǎng)中,需要根據(jù)細胞種類和培養(yǎng)條件的不同選擇合適的合成細胞培養(yǎng)基。目前,在動物細胞培養(yǎng)中常用的基礎細胞培養(yǎng)基有BME、MEM、DMEM、RPMI-1640、Ham F12、M199 等。由于天然培養(yǎng)基的一些營養(yǎng)成分不能被合成細胞培養(yǎng)基*代替,因此一般需在合成細胞培養(yǎng)基中添加5%~10%的胎牛血清。胎牛血清的加入對細胞培養(yǎng)非常有效,但胎牛血清的成分復雜,這對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、純化和檢測會帶來一定的不便,為減少胎牛血清的影響,開發(fā)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞培養(yǎng)基,可以將胎牛血清的使用量降低到1~3%。

無血清細胞培養(yǎng)基(serum free medium, SFM)是指在使用中無需添加血清的細胞培養(yǎng)基,且其組成成分不含有任何動物組分。按照其組分分類,還可以分為無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基和化學限定無血清細胞培養(yǎng)基,前者組分中可能含有某些植物來源成分,而后者*由化學成分明確的組分組成。

其中,無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應用廣泛的,它提高了細胞培養(yǎng)的質(zhì)量,避免了使用血清帶來的麻煩。目前,已有多種無血清培養(yǎng)基上市,如雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)基、CHO細胞無血清培養(yǎng)基、Vero細胞無血清培養(yǎng)基和NS0 細胞無血清培養(yǎng)基等。無血清培養(yǎng)基通常添加生長附加成分,如激素與生長因子、低分子營養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)鐵蛋白等促細胞生長的附加成分,一般包括胰島素、孕酮、sodium selenate、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

   

 

細胞培養(yǎng)基的基本成分
 
03

細胞培養(yǎng)基的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加一定量的血清使細胞生長和繁殖。

氨基酸:組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細胞對氨基酸的需求各異,但幾種必需氨基酸細胞自身不能合成,必須依靠培養(yǎng)液提供,如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸,細胞可以自己合成,或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求,因為谷氨酰胺是作為能源及碳源物質(zhì)同時被細胞利用,是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡,所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體,D型氨基酸不能被利用。

維生素:維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì),對細胞代謝有重大作用。它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶,沒有它們,酶便沒有活性,代謝活動將無法進行。維生素分為水溶和脂溶兩大類,培養(yǎng)液中直接采用ATP和CoA。

葡萄糖:大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來源之一。

無機鹽:維持培養(yǎng)基滲透壓平衡,參與細胞的代謝活動。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 等。Na+是細胞外液中最主要的陽離子,對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細胞內(nèi)液,細胞內(nèi)K+對于激活某些酶是必需的,并在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細胞之間相互粘著,在細胞內(nèi)參與許多重要的細胞生理活動,如傳導、參與肌肉細胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時,為了減少細胞的聚集和附著,要減少Ca2+的濃度。Mg2+是構(gòu)成細胞間質(zhì)的重要成分,對于細胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對細胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。

其他成分:表皮生長因子、胰島素、多肽、核苷、嘌呤等??蓭椭毎目寺』囵B(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。

  

 

血清的應用
 
04

血清:用于細胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清,培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因主要是來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長期的實際應用人們對其有比較深入的理解。

牛血清可分為胎牛血清、新牛血清、小牛血清。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛。新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛。小牛血清取自出生10~30 天的小牛。其中,胎牛血清品質(zhì)好是因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的,但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。牛血清中含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份,具有極為重要的功能。

血清的主要作用:1) 提供基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質(zhì)。2) 提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素(Cortisol、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。3) 提供結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì),如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。4) 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷,對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。

血清的優(yōu)點和缺點:血清是非常復雜的混合物,成分多樣,含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子,有的對細胞生長有促進作用,如含有攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素和脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運蛋白等。血清能夠提供細胞貼壁因子和擴散因子。血清中含有起穩(wěn)定作用和解毒的因子,能夠維持培養(yǎng)基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。

但是,血清的加入也帶來了很多問題:1) 血清的成份可能有幾百種之多,目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚,尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識,這給研究工作帶來許多困難。2) 血清都是批量生產(chǎn),各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制。3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)。4) 對大多數(shù)細胞,在體內(nèi)狀態(tài),血清不是它們接觸的生理學液體,只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清,因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài),血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。5) 血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì),如多胺氧化酶,能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長,甚至造成細胞死亡。6) 取材中可能帶入支原體、病毒,對細胞產(chǎn)生潛在影響。7) 血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難,其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。8) 大規(guī)模生產(chǎn)中,血清來源越來越困難,價格昂貴,是構(gòu)成生產(chǎn)成本的主要部分之一。9) 為了使與傳染源相關(guān)的風險減少到minimum,存在多個國家間限制進出口生物材料的國際法規(guī)。

 

 

細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品舉例
 
05

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
Gibco進口部分
11875093 RPMI 1640 Medium 500ml
11965092 DMEM,高糖 500ml
11995065 DMEM,高糖,含丙酮酸鹽 500ml
11330032 DMEM/F-12,HEPES 500ml
11090081 MEM,不含谷氨酰胺 500ml
16600082 McCoy's 5A (改良)培養(yǎng)基 500ml
14200075 DPBS (10X),無鈣、無鎂 500ml
31985070 Opti-MEM™ I 減血清培養(yǎng)基 500ml
15140122 青霉素-鏈霉素(10,000 U/mL) 100 ml
25200072 胰蛋白酶-EDTA (0.25%),含酚紅 500ml
25200056 胰蛋白酶-EDTA (0.25%),含酚紅 100 ml
12561049 MEM α,無核苷 1000ml
17504044 B-27™ Supplement (50X), serum free 10ml
17504001 B-27™ Supplement (50X), serum free 100 mL
17502048 N-2 添加劑 (100X) 5ml
17502001 N-2 添加劑 (100X) 50ml
17101015 II 型膠原酶,粉末 1g
17104019 IV 型膠原酶,粉末 1g
12440053 IMDM 500ml
10270106 南美血清 500ml
10099141 澳洲胎牛血清 500ml
10099141C Fetal Bovine Serum, 澳洲胎牛血清 500ml
21127022 Ham's F-12K (Kaighn's) 培養(yǎng)基 500ml
14190144 DPBS,無鈣、無鎂 500ml
11095080 MEM 500ml
10010023 PBS,pH 7.4 500ml
Gibco國產(chǎn)部分
C11995500BT DMEM basic (1X) 500ml
C11875500BT RPMI Medium 1640 basic (1X) 500ml
C10010500BT PBS pH 7.4 basic (1X) 500ml
C12571500BT MEM Alpha basic (1X) 500ml
C11330500BT DMEM/F-12,HEPES 500ml
C11885500BT DMEM,低糖,含丙酮酸鹽 500ml
C11965500BT DMEM,高糖 500ml
C11095500BT MEM 500ml
C11765500BT Ham's F-12 Nutrient Mix 500ml
C11150500BT 199 培養(yǎng)基,Earle's 平衡鹽 500ml
附帶:Corning耗材(部分
3516 6孔細胞培養(yǎng)板 50塊/箱,1塊/包
3513 12孔細胞培養(yǎng)板 50塊/箱,1塊/包
3524
24孔細胞培養(yǎng)板 100塊/箱,1塊/包
3548 48孔細胞培養(yǎng)板 100塊/箱,1塊/包
3599 96孔細胞培養(yǎng)板 100塊/箱,1塊/包
3799 96孔U底細胞培養(yǎng)板 50塊/箱,1塊/包
430165 35mm細胞培養(yǎng)皿 25包/箱,20個/包
430166 60mm細胞培養(yǎng)皿 25包/箱,20個/包
430167 100mm細胞培養(yǎng)皿 25包/箱,20個/包
430599 150mm細胞培養(yǎng)皿 12包/箱,5個/包
430168 25cm正方斜口細胞培養(yǎng)瓶 25包/箱,20個/包
430639 25cm正方透氣蓋斜口細胞培養(yǎng)瓶 10包/箱,20個/包
430720 75cm正方黃蓋斜口細胞培養(yǎng)瓶 20包/箱,5個/包
430641 75cm正方透氣蓋斜口細胞培養(yǎng)瓶 20包/箱,5個/包
430823 150cm正方斜口細胞培養(yǎng)瓶 10包/箱,5個/包
430825 150cm正方透氣蓋斜口細胞培養(yǎng)瓶 10包/箱,5個/包

   

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